Hintergründe
Diclofenac ist ein typisches nichtsteroidales Antirheumatikum (NSAR). Aufgrund seiner analgetischen, entzündungshemmenden und fiebersenkenden Wirkung kann es bei einer Vielzahl von Krankheiten  (z.B.: Rheuma, Prellungen, Zerrungen, Hexenschuss, Arthrose und Arthritis) als Schmerzmittel eingesetzt werden. Die Wirkung beruht auf der nicht-selektiven Hemmung von Cyclooxygenasen (COX), die im  menschlichen Körper bzw. bei größeren Säugetieren die Entzündungsmediatoren (Prostaglandine) bilden. Diclofenac ist nicht als Arzneimittel für Tiere zugelassen, die Milch für den menschlichen Verzehr  produzieren, jedoch gilt dies nicht für fleischproduzierende Tiere. Die Europäische Kommission hat in diesem Fall einen Rückstandshöchstgehalt von 0,1 µg/L festgelegt. Es wurden Studien an Milchkühen  durchgeführt, wobei die Milch nach einer dreitägigen intramuskulären Anwendung von 2,5 mg/kg Diclofenac pro Tag auf Rückstände untersucht wurde. 12 Stunden nach der letzten Anwendung wurden Diclofenac-Rückstände von 3,76 μg/kg bestimmt. 108 Stunden nach der letzten Anwendung konnte kein Diclofenac nachgewiesen werden, da seine Konzentration unter die Nachweisgrenze von 0,03 μg/kg gefallen war. Zur Einhaltung und Überwachung dieser Grenzwerte werden modernste Methoden und Techniken eingesetzt. In der Milchindustrie ist es beispielsweise wichtig, schnelle Testergebnisse zu erzielen, da längere Verweilzeiten großer Milchmengen kostspielig sind. Mikrobiologische Inhibitortests sind relativ zeitaufwändig, chromatographische Methoden sind kostenintensiv und rezeptor- und enzymbasierte Methoden können nur einzelne Substanzklassen identifizieren.

Mit analytischen Microarrays und automatisierten Auslesesystemen ist es möglich, eine schnelle, praxistaugliche Detektion mit mehreren Analyten gleichzeitig durchzuführen. Diese Vorteile bietet auch der BioSensor MCR-A (Microarray Chip Reader mit Autosampler), der beim Milchprüfring Bayern e.V. seit 2008 routinemäßig zur simultanen Identifizierung von 15 verschiedenen Antibiotika in Rohmilch eingesetzt wird. Das System basiert auf einem automatisierten indirekten kompetitiven Chemilumineszenz-Microarray-Immunoassay und kann die folgenden 15 Substanzen qualifizieren und quantifizieren: Sulfamethazin, Sulfadiazin, Streptomycin, Cloxacillin, Ampicillin, Penicillin G, Cephapirin, Neomycin B, Gentamicin, Tylosin, Enrofloxacin, Nafcillin, Ceftiofur, Cefalexin und Cefoperazon.

In den letzten 12 Jahren wurden beim Milchprüfring Bayern e.V. fast 12.000 Proben nachuntersucht, die im Hemmstoff-Screening im Rahmen der Milch-Güteverordnung positiv getestet wurden. Da der MCR-A nicht nur bestätigt, dass Hemmstoffe in der Milchprobe sind, sondern genau feststellt welche Substanz in welcher Konzentration vorliegt, wird die Ursachenforschung nach dem Grund des Hemmstoffeintrages sehr effektiv unterstützt. Diese nützen die Mitarbeiter der Molkereien und des Milchprüfrings sowie auch die Amtstierärzte sehr gerne für Ihre Aufklärungs- und Beratungstätigkeit. Anhand bestimmter Antibiotika-Kombinationen kann man unter Umständen Rückschlüsse auf das verwendete Medikament ziehen.

Ziel
Ziel ist eine  Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Senkung der Nachweisgrenze in Rohmilch und die Verbesserung der Wiederfindung. Nach Etablierung des Nachweises in die Laborroutine wird die Methodik fürs zusätzliche Screening der vorhandenen Rohmilchproben auf etwaige Diclofenac-Verunreinigungen eingesetzt. Der tatsächliche Einsatz von Diclofenac bzw. die Qualifizierung und Quantifizierung des Rückstandes tragen dazu bei, die Folgen für Mensch und Tier besser bewerten zu können  und ein Mehr an Sicherheit in der Produktionskette Milch zu generieren. Des Weiteren soll der bereits erfolgreich eingesetzte Antibiotika-Chip um den Wirkstoff Diclofenac erweitert werden, so dass zukünftig beide Wirkstoffklassen gemeinsam mit lediglich einer Messung am MCR-A erfasst werden können.

Ergebnis
Andreas Auernhammer (TU München, Institut für Wasserchemie, eingereicht am 14.04.2020) zeigte in seiner Masterarbeit, dass der MCR A auch erfolgreich zum direkten Nachweis von Diclofenac in Milch eingesetzt werden kann. Kalibrierungsmessungen in UHT-Milch ergaben eine Nachweisgrenze LOD von 0,264 μg/L und einen IC50 von 1,005 μg/L für Diclofenac. Der generierte Arbeitsbereich lag zwischen 0,468 – 2,158 μg/L. In der Matrix H Milch konnten Wiederfindungsraten von durchschnittlich 99 ± 7% für Diclofenac festgestellt werden.

Aktuell wird Diclofenac mittels BioSensor MCR-A nicht qualifiziert und quantifiziert nachgewiesen. Grund ist das niedrige Interesse an dem Nachweis von Diclofenac in der Milch.

Hintergründe
Seit Mitte 2020 gibt es neue europäische, gesetzliche Höchstwerte für Chlorat und Perchlorat in Lebensmitteln. Diese sorgen für einen vermehrten Fokus auf die Verringerung dieser Gefahrstoffe. Folglich steigen auch die Anforderungen an die Molkereien und Landwirte in Europa. Verarbeiter und Hersteller von Lebensmitteln (auch Babynahrungshersteller) müssen Waren daraufhin weitreichender überprüfen. Dieser Prüfprozess ist langwierig sowie mit erheblichem Organisationsaufwand und Mehrkosten verbunden.

Chlorat und Perchlorat sind insbesondere bei einer regelmäßigen Aufnahme gesundheitlich problematisch. Sie hemmen unter anderem die Jodaufnahme in der Schilddrüse, was zu einer Schilddrüsenvergrößerung führen kann. Chlorate und Perchlorate können entstehen, wenn Chlor oder Chlorverbindungen zur Desinfektion von Wasser eingesetzt werden. Damit soll verhindert werden, dass Wasser zum Beispiel in Rohrleitungen verkeimt. Wird gechlortes Wasser zum Bewässern von Nahrungspflanzen oder in der Lebensmittelproduktion (beispielsweise zum Waschen/Glasieren von Obst und Gemüse oder zum Rückverdünnen von Saftkonzentraten) verwendet, können Chlorat-Rückstände in die Lebensmittel gelangen. Auch durch chlorhaltige Reinigungsmittel kann es zu Rückständen im Lebensmittel kommen. Perchlorat ist außerdem ein natürlicher Bestandteil von Chilesalpeter. Durch die Verwendung von Chilesalpeter in Düngemitteln kann dies zur Kontamination und Anreicherung in den Böden und Kultursubstraten mit Perchlorat führen. Das wasserlösliche Salz wird dann von den Pflanzen aufgenommen und gelangt in die Lebensmittelkette.

Ziel
Methodenentwicklung zum Nachweis von Perchlorat/Chlorat in Milch mit der Option einer Ausweitung auf weitere Einsatzgebiete und darüber hinausgehende Analyse beim Milchprüfring Bayern e.V.

Der PC/C-Nachweis soll über eine schnelle und preiswerte Analyse via Ionenchromatographie (IC) erfolgen. Durch eine neuartige, spezielle Filtrationstechnik mittels Zentrifugalkraft ist die Probenaufbereitung sehr einfach und wenig zeitintensiv. In enger Zusammenarbeit mit dem MPR Baden-Württemberg , der Fa. Sartorius und der Fa. Tec2-Fit GmbH wurde diese Applikation entwickelt und erfolgreich umgesetzt. Im Rahmen dieses Projekts soll diese neuartige Art der Probenvorbereitung inklusive anschließender IC-Analyse standardisiert und bis zu einer Routineanwendung im Labor implementiert werden. Ein wichtiges zusätzliches Element eines Dienstleistungspakets zur Rückstandsanalytik für die Molkereien ist die Herstellung einer smarten Poolprobe aus Einzellieferantenproben, die im mpr-Labor auf Inhaltsstoffe untersucht werden. Mit Hilfe einer derartigen Poolprobe können alle Szenarien der Milchsammelkette ohne Logistik vor Ort nachgebildet werden. Anhand der einzelnen Probendaten und der genauen Milchmenge pro Lieferant wird es möglich, jede beliebige Tourgesamtprobe nachzubilden und als Poolprobe herzustellen. Diese Poolprobe soll im Rahmen des Projektes dann auf den Gehalt von PC/C untersucht werden. Ein weiterer Vorteil eines solchen Konzepts ist es, dass bei positivem Befund der Poolprobe dann unmittelbar im Anschluss die einzelnen Proben nachuntersucht werden können, um den/die Verursacher zu ermitteln. In regulären Screening- und Monitoring-Schemata ist dies aufgrund von Versand- und Analysezeiten in Fremdlaboren nicht darstellbar. Der mpr erwartet sich damit einen neuen Dienstleistungsbereich zu begründen, der in Zukunft zur Laborauslastung beitragen kann und den Molkereien neue Optionen für individuelle Screening- und Monitoring-Konzepte bietet.

Ergebnis
Es konnte die Herstellung von Poolproben etabliert, die Probenaufbereitung angepasst und erfolgreich die IC-Messungen von gefärbte und konservierten Rohmilchproben durchgeführt werden. Die Wiederfindungsmessungen zeigen eine Wiederfindung von 104% bei Perchlorat und 90% bei Chlorat. Kalibriermessungen mit einer Nachweisgrenze von 6ppb wurden reproduzierbar durchgeführt. Auftragsmessungen liefen erfolgreich und die Absicherung dieser Ergebnisse durch das Labor Fiedle zeigten eine gute Übereinstimmung. Verschleppungsversuche durch vorherige Kombi-Untersuchungen bzw. durch die Poolprobenherstellung mit einer Pipettenspitze waren negativ. Somit ist die Verwendbarkeit für die Routineanalytik beim  mpr gegeben.

Leider konnte die Validierung der neuen Untersuchungsmethode, sowie Auftragsmessungen nicht durchgeführt werden. Die Ursache dafür, ist die Umstrukturierung beim mpr hinsichtlich der Organisation, weshalb das IC-Projekt vorerst nicht weiter verfolgt wird. Ebenso ist der aktuelle Bedarf an Probenuntersuchungen zu gering um diese Methode bei mpr zu etablieren.

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