Hintergründe
Die Referenzmethode ISO 13366-1 |IDF 148-1 zur Mikroskopische Zählung somatischer Zellen in Milch ist sehr arbeitsintensiv und bietet leider nur eine schlechte Präzision, wie auch eine stark subjektive Beurteilung der Zellzahl. Bisher mussten 10% der Gesamtfläche eines Trockenpräparates einer Milchprobe analysiert werden. Dieser Vorgang muss bis zu 6x wiederholt werden, um eventuelle Ausreißer bei den Ergebnissen zu erkennen. Ebenfalls wird die Auswertung der Zellzahl durch eine subjektive Beurteilung d.h. die Auswertung durch eine einzelne Person, negativ beeinflusst. Bei den einzelnen Wiederholungen der mikroskopischen Analyse der Milchprobe, können die Werte sehr weit, zum Teil um 100.000 Zellen/mL und mehr, auseinanderliegen. Bei automatisierten Verfahren liegt der entsprechende Wert für die Wiederholbarkeit deutlich darunter. Das hat in der Praxis dazu geführt, dass die Referenzmethode der mikroskopischen Zellzahlbestimmung nur wenig angewandt wird und Routinegeräte oft nur mit anderen Routinegeräten und nicht mit der Referenzmethode überprüft und justiert werden.

Ziel
Das Miami-Projekt wurde darauf ausgelegt, die bisherige Referenzmethode für die Zellzahlbestimmung (= mikroskopische Zellzahlbestimmung), die im 20. Jahrhundert entwickelt und als Standard festgelegt wurde, durch die neuen Errungenschaften des 21. Jahrhunderts zu verbessern. Dies soll über verbesserte, neue Färbetechniken mit Fluoreszenzfarbstoffen, eine automatisierte, software-basierte Bildanalyse sowie den Aufbau einer Bildbibliothek von unterschiedlichen Zelltypen erfolgen. Zudem soll die Referenzmethode um die Zelldifferenzierung erweitert werden.

Ergebnis
Ziel des Projektes war es die Genauigkeit der ISO 13366-1 |IDF 148-1-Mikroskopmethode – Referenzmethode zur Zählung somatischer Zellen in Milch – zu verbessern. Das Projekt legte ein Verfahren fest, das es ermöglicht, flüssige Milch zu analysieren und digitale Bilder mit der Mikroskopmethode zu erfassen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Verfahren präziser ist als die heutigen ISO 13366-1 |IDF 148-1 (Trockenpräparate, die stark von der menschlichen Lesart beeinflusst sind). Die Möglichkeit, digitale Bilder zu speichern, kann insbesondere bei der Charakterisierung von primärem oder sekundärem Referenzmaterial einen objektiven Nachweis der gezählten Zellen liefern. Die erhaltenen Ergebnisse unterscheiden sich statistisch nicht von den Ergebnissen, die mit der FOE-Methode mit der an EU JRC CRM angepassten Kalibrierung erhalten wurden. Im ISO/IDF-Ausschuss für Statistik und Automatisierung wurde vorgeschlagen, einen Anhang in die ISO 13366-1 |IDF 148-1 aufzunehmen, der das MIAMi-Verfahren beschreibt.

Die IDF wird Anfang 2023 ein Verfahren für neue Arbeitsaufgaben zur Genehmigung einleiten.

Hintergründe
Durch Beobachtung wurde immer wieder festgestellt, dass Proben von Lieferanten mit sehr hohen Keimwerten auch öfters wegen „nicht konserviert/weiß“ storniert wurden. Es kam der Verdacht auf, dass bestimmte Keime den Farbstoff E110 in der Azidiolkonservierung abbauen und deshalb trotz vorhandener Konservierungsstoffe eine scheinbar nicht konservierte/weiße Probe simulieren.

Ziel
Ziel ist es das Konservierungsmittel in entfärbten Keimproben mit hoher Keimzahl beim Milchprüfring Bayern e.V. nachzuweisen, um die Stornierung der Ergebnisse wegen „nicht konserviert“ zu vermeiden und dem Lieferanten schnellst möglichst eine Information über das Keimzahl-Problem geben zu können.

Ergebnis
Grundlage für den Azid-Nachweis, ist ein qualitativer chemischer Nachweis von Azid in Milch. Zur Bestimmung der Azid-Konzentration wurde die von Dilworth und Thorneley (1981) beschriebene Methode angewendet.  Dazu wurde in Abwandlung zur beschriebenen Methode die "entfärbte“ Milchprobe angesäuert und durch Zugabe von Eisen(III)chlorid bei Raumtemperatur der gelb-rötliche Niederschlag aus Eisenazid beobachtet. Bei Abwesenheit von Azid (ein Bestandteil der Konservierung) bleibt die Probe gelb.

Beurteilung und Bewertung des Ergebnisses:
Da es sich um einen qualitativen Nachweis von Azid handelt, wird eine visuelle Bewertung vorgenommen. Als positiv werden alle Proben gewertet, die in einen orange-roten Farbton umschlagen. Nicht konservierte Proben (negatives Ergebnis) bleiben eindeutig gelb. Bis zu einer Konservierungsmenge von 50 % ist das Ergebnis eindeutig negativ. Als Vergleich dient der Positiv-Standard. Wird konservierte Milch über die Untersuchungsgeräte etc. in die zu beurteilende Probe verschleppt ist das Ergebnis eindeutig negativ.

Der vorgeschlagene Azidnachweis ist also ausreichend zur Beurteilung entfärbter Keimproben auf das Vorhandensein von Konservierungsmittel in der Probe. Ausschlaggebend für die positive Einstufung ist der Farbvergleich mit dem Positiv-Standard. Gleiche Farbintensität der entfärbten Keimprobe entspricht einem Vorhandensein von genügend Konservierungsmittel. Das Ergebnis der Keimzahluntersuchung kann in die Bewertung eingehen.

Reagenzglas #1 Kontrollmilch konserviert mit Azidiol

Reagenzglas #2 unkonservierte Kontrollmilch

Reagenzglas #3 Probe, bei der die Konservierung in Frage gestellt wird; Nach Durchführung des Azidiol Test´s reagieren azidiolhaltige Proben mit einem rötlich-rostige Farbumschlag

Folgerung:
Der Test kann dazu benutzt werden entfärbte Keimproben mit Keimwerten >= 1050.000 zu werten, wenn das Ergebnis des Azid-Nachweises eindeutig positiv (=Farbintensität entspricht dem pos. Standard) ist.

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